- 生物性重复：同一个指标至少需要3-4个独立样本（一般为3个，较高要求为4个）；
- 技术性重复：同一个样本重复检测3-4次独立数据（一般为3个，较高要求为4个）。
参考基因（又称内参基因）通常是为了证明当前实验检测参数的可比性基准标尺，根据实验设计选择合适的参考基因，一般为管家基因，但需要注意的是部分基因的表达部位和超微结构，否则也不能作为最适参考，最终可能会导致实验数据无效，从而得出错误的判断。
一般情况下，内参基因和目的基因需要在同一批次的反应体系中进行比较，也就意味着需要将内参基因和目的基因设置在同一个批次的检测排板中，因此，如果按照最低重复三次的标准，那么每一个检测板次（批次）最多检测16个样本（见检测板设置参考图）。
为了便于加样精准统一，在面对加样板情况下。强烈建议按照”横向加基因，纵向加样本“的整体布局设置加样排板，有利于后期加样操作。参考下图：
qPCR反应是一个极其精密的过程，样本量的准确性直接决定了最终反应结果。因此加样过程须尽量统一手法，针对同一个检测 样本，除了目的基因（此时内参基因也应按照目的基因进行配制）的引物不同之外，其余反应体系试剂都是一样的，因此在配制体系时要考虑到加样数量，为保证加样充分，需要配制2-3个加样孔的数量，加样时有两种加样方式，一种是将所有反应体系配制好后统一分装加样；另一种是先分装配置好的反应体系，然后再统一加入样本（模板）。样本量大时建议采用第二种方式。
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